在實驗的過程中經常會遇到保留時間不穩定的問題，我們也總接觸到相關問題的技術咨詢。我們的技術工程師深知大家的痛點，特根據大家的反饋，梳理了一個從發現問題到處理問題的解決思路。以后再遇到保留時間不穩定的問題，就可以輕松搞定啦。

保留時間不穩定，會是什么問題？

首先要找出變化的模式，

這個會幫助我們找到很多潛在的原因。

#1 保留時間在同一天變化大，同一瓶流動相，同一根色譜柱，同一臺儀器

1）首先檢查泵和混合器。使用秒表和量筒來檢測流速（設置儀器流速1ml/min，用10ml量筒收集流出液10分鐘，應該得到液體約10ml±0.5ml，量筒有誤差，使用的試劑與儀器廠家標定泵流速時試劑不一樣，最終體積也有些差異，如果超過這個范圍，再分開通道檢測，以找到流速不正確的原因，并排除）；

2）檢查流動相組成是否變化，可以在流動相中加入跟蹤劑來觀察基線的變化，例如：反相條件，UV檢測器，在有機相中加入0.1%丙酮，監測254nm下的基線變化，還有一種方法人工配制流動相，然后通過混合器，這時候保留時間穩定了，不再波動，那就是混合器工作不正常，或者混合不均勻，進行排除。

#2 保留時間一天之內正常，不同天數之間變化

1）儀器本身不太可能有問題，可能是流動相的組成變化引起的，在反相色譜中，保留因子k和流動相中的有機溶劑的體積含量成指數關系，根據經驗，如果有機溶劑含量誤差在1%，那保留時間的變化在5%-15%之間，大部分變化在10%左右，意味著用稱量有機溶劑的方式配置流動相能得到更穩定的保留時間；

2）流動相的脫氣方式也可能導致，*脫氣方式是使用真空超聲脫氣大約1分鐘左右，非真空條件下超聲脫氣5分鐘，這樣會Z大程度的減少溶劑的揮發，還有一種方法是流動相中通過氦氣，流動相被氦氣平衡后，氦氣流立刻關閉，避免氦氣帶走溶劑蒸汽，而導致溶劑組成改變；

3）流動相的抽濾方式，通常情況下，如果我們使用有機溶劑和水相混合流動相時，會先將流動相配置混勻好后，再進行抽濾，這樣的好處是流動相混合更均勻，但是對于流動相中沸點較低的部分，在抽濾過程中會損失更大，導致流動相溶劑組成改變，建議有機相和水相分開抽濾，再進行混合，超聲脫氣；

4）檢測目標物是離子狀態或者離子化的，那么控制流動相的pH就非常重要，就算是0.1單位pH的變化都有可能導致保留時間漂移10%左右，所以準確稱量pH值并保證pH儀被很好的校正了，在反相色譜柱中，隨著pH值的升高，酸的保留會減少，堿的保留會增加。

反相色譜中，分離離子或離子化的樣品，保留時間會受到正確緩沖溶液的離子強度的影響，但影響會很小，可以不計，典型狀況是緩沖鹽的摩爾數改變20%，保留時間的變化是1%，緩沖鹽的組成通常是稱量的，那么大的誤差是不會發生的。

#3 保留時間漂移

還有影響保留時間的一個重要問題就是保留時間漂移（一直延長或一直縮短）。

1）大部分工作者認為漂移是平衡的問題，如果使用的是未修飾硅膠柱做正相色譜，這是最有可能的原因，使用半飽和流動相改善。反相色譜中，平衡通常會很快，5-10個柱體積的流動相通常就足夠平衡了，但不全是如此，典型的就是離子對色譜中，使用離子對試劑平衡色譜柱，由于離子對試劑的濃度在2-5mmol/L甚至更低的濃度，它們要吸附在反相色譜柱填料表面，表面濃度在0.5-2μmol/m2，1根4.6*250mm的色譜柱大約有3g填料，需要2mmol的離子對試劑進行*的柱平衡，流動相濃度為2mmol時，那需要1L流動相進行平衡，這個雖然是J端條件，但是用幾百毫升的流動相去平衡色譜柱也是正常的，因此離子對色譜中，使用了有機溶劑清除了離子對試劑，這樣第二天需要更長的時間平衡色譜柱。這兩個現象都是流動相中有低濃度的強吸附試劑導致的，這是保留時間漂移最常見的原因，也還有別的原因。

2）樣品中含有強吸附劑，在重復進樣中會慢慢累積，從而改變色譜柱的化學性質，如：藥品的賦形劑。可以通過觀察保留時間變化的速率來得知雜質是從流動相中引入還是樣品中引入。實驗如下：

● 進樣幾次，如：進樣四次，共使用了1個小時；

● 走相同量的流動相，不進樣；

● 重復第一步；

● 做一個關系圖；

保留時間：▲ 對時間的關系     ▲ 對進樣次數的關系

如果第一個圖得到一條平滑的曲線，那么流動相是引入雜質的原因，如果第二個圖得到一條平滑的曲線，那么雜質的來源是樣品。

3）鍵合相水解，色譜柱制造商會制定一個pH范圍，超出范圍可能導致鍵合相不穩定，然而，很多情況下使用者不得不在接近這個pH極限，但是并沒有一個明顯的分界線，因為水解還取決于其他因素，如：溫度，有機溶劑，緩沖鹽的濃度和種類，樣品的化學性質等，因此這個水解也可能發生在這個pH范圍內。要保存固定相的水解穩定性，最好是在中性pH值（3-5左右）和低溫下。等度條件穩定性優于梯度條件，在等度條件下發生水解的過程中，鍵合相通常會發生自我吸附，并達成一種區域平衡，在使用高濃度的有機溶劑時，在梯度時或者沖洗色譜柱時，這種平衡會被打破，鍵合相被沖出色譜柱。

4）溫度的變化，如果樣品是自動分析過夜或者過了周末，那保留時間的漂移可能和實驗室的溫度變化有關，在很多地方，室溫的設置在晚上或者周末是不一樣的，一般來講，1℃的變化導致保留時間的漂移大約在1%到2%。這個可以聯系最后一個導致保留時間漂移的原因--柱壓的增加，柱壓的異常升高，表明色譜柱被污染，僅僅是篩板被堵塞就可能導致保留時間漂移，這是因為，為了使流動相通過篩板，需要額外的壓力來促使流動相通過篩板，這會使流動相在摩擦的過程中受熱，從而導致保留時間的漂移。

5）反相色譜鍵合相發生了“相塌陷”，由于流動相中有機溶劑比例太少，高鍵合覆蓋率、“*封端”的C18沒有很好的被流動相浸潤，這會使得流動相和固定相沒有很好的接觸，造成鍵合相卷曲，固定相之間相互吸附，從而導致固定相可以和樣品相互作用的表面積減少，使得保留時間逐漸變短。這時候立即用一定量的有機溶劑（建議40%乙腈水）沖洗色譜柱可以使鍵合相恢復，這種現象在短鏈烷烴結合，未封尾的反相鍵合相上則很少發生，或者是不發生。