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021-50276769體積排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，通常用于分子量大于2000的樣品的分離。SEC方法zui廣泛的用途是測(cè)定聚合物的分子量分布，對(duì)某些大分子樣品如蛋白質(zhì)、核酸等，也是種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡(jiǎn)便快速地分離樣品中分子量相差較大的組分，因而適合于未知樣品的初步探索性分離，無需進(jìn)行復(fù)雜實(shí)驗(yàn)就能較為全面地了解樣品組成分布的概況。
體積排阻色譜原理
分子的體積排阻，樣品組分和固定相之間原則上不存在相互作用，色譜柱的固定相是具有不同孔徑的多孔凝膠，在固定相確定的分子量范圍內(nèi)，洗脫順序按照分子大小分布。當(dāng)樣品分子量較大，以至于被wan全排除在固定相微孔之外時(shí)（全排阻），其保留體積等于色譜柱內(nèi)微粒間的空隙體積；而分子量足夠小的分子可以wan全進(jìn)入微孔中，其保留體積為空隙體積和固定相中微孔體積之和，因此小的溶質(zhì)分子保留時(shí)間長(zhǎng)，洗脫體積大，而大的溶質(zhì)分子保留時(shí)間短，洗脫體積小。固定相的分子量測(cè)定范圍即為全滲透和全排阻之間的分子量范圍。
理想的體積排阻色譜固定相應(yīng)具有窄的孔徑分布范圍，而系列色譜固定相應(yīng)具有寬范圍的孔徑分布，可根據(jù)樣品的不同選擇不同分子量范圍的SEC柱，也可將不同規(guī)格的SEC柱串聯(lián)使用，用于分離更大分子量范圍的樣品。
體積排阻色譜的分類
凝膠過濾色譜法-GFC
一般用于分離水溶性的大分子，凝膠的代表是葡聚糖系列，洗脫溶劑主要是水。
凝膠滲透色譜法-GPC
主要用于有機(jī)溶劑中可溶的高聚物相對(duì)分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫呋喃等有機(jī)溶劑。
兩種方法的分離原理雖然相同但采用的固定相、分離對(duì)象和使用技術(shù)wan全不同。
分類 | 凝膠過濾色譜 GFC | 凝膠滲透色譜 GPC |
固定相 | 低交聯(lián)度多孔聚合物 （在有機(jī)溶劑中會(huì)溶脹） 如葡聚糖，瓊脂糖， 聚丙烯酰胺 | 交聯(lián)聚苯乙烯樹脂 （在有機(jī)溶劑中溶脹性較小）如聚乙烯-二苯乙烯共聚物 |
流動(dòng)相 | 采用水溶液或緩沖液 作為流動(dòng)相 | 有機(jī)溶劑，THF，DMF， 三氯ji烷等 |
應(yīng)用對(duì)象 | 多肽生物大分子蛋白質(zhì)， 纖維素衍生物， 聚乙烯醇多糖類 | 結(jié)晶合成聚合物， 小分子聚合物 |
優(yōu)缺點(diǎn) | 條件溫和， 分離機(jī)理簡(jiǎn)單， 操作參數(shù)少， 耐高溫， 選擇性低 | 使用廣泛，滲透性好， 柱效高，不宜長(zhǎng)期高溫 條件使用 |
體積排阻色譜流動(dòng)相的選擇
體積排阻色譜法中，實(shí)際的分離效果與樣品、流動(dòng)相之間的相互作用無關(guān)，因此改變流動(dòng)相的組成一般不會(huì)改變分離度。當(dāng)采用示差折光檢測(cè)器時(shí)，為提高檢測(cè)靈敏度，應(yīng)使流動(dòng)相的折射率與被測(cè)樣品的折射率有盡可能大的差別。若使用紫外吸收檢測(cè)器，也應(yīng)采用在檢測(cè)波長(zhǎng)無紫外吸收的溶劑。
體積排阻色譜法中流動(dòng)相的選擇原則：
01
流動(dòng)相對(duì)樣品應(yīng)有足夠的溶解能力，黏度小，與檢測(cè)器匹配。
02
流動(dòng)相必須與固定相匹配，能浸潤(rùn)凝膠，如對(duì)苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相選擇非極性流動(dòng)相；多孔硅膠固定相應(yīng)選擇極性強(qiáng)的流動(dòng)相。
03
為增加樣品溶解度而采用高柱溫操作時(shí)，應(yīng)選用高沸點(diǎn)溶劑。
凝膠滲透色譜主要用于高聚物分子量的測(cè)定。四氫呋喃對(duì)此類樣品有良好的溶解性能，可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被廣泛使用作為GPC流動(dòng)相。但因其在儲(chǔ)運(yùn)過程中特別是在光照射條件下，容易生成過氧化物，使用前必須除去。二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、間甲酚等溶劑可在高柱溫條件下使用；強(qiáng)極性的六氟異丙醇、三氟乙醇等可用于粒度小于10μm的凝膠柱。
在凝膠過濾色譜中，通常以具有不同pH值的緩沖溶液作為流動(dòng)相。當(dāng)采用親水性有機(jī)凝膠（葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）、硅膠或改性硅膠為固定相時(shí)，固定相與樣品間可能存在多種相互作用影響GFC測(cè)定準(zhǔn)確性，可在流動(dòng)相中添加少量無機(jī)鹽以保持一定的離子強(qiáng)度（0.1~0.5mol/L），其中鈉、鉀、銨等的硫酸鹽、磷酸鹽消除吸附作用的效果較好。當(dāng)使用硅膠基質(zhì)凝膠時(shí)，流動(dòng)相的pH值應(yīng)保持在4~8的范圍，以免硅膠鍵合相被破壞。
月旭產(chǎn)品介紹
月旭科技Xtimate® SEC填充劑采用du特的化學(xué)鍵合技術(shù)，在硅膠表面鍵合親水性聚合物以及親水性二醇基團(tuán)，雙重鍵合機(jī)制使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應(yīng)用于水溶性聚合物及生物大分子的分離和測(cè)定。
固定相 | SEC- 120 | SEC- 300 | SEC- 500 | SEC- 700 | SEC- 1000 | SEC- 2000 |
填充劑 | 球狀親水改性硅膠 | |||||
孔徑? | 120 | 300 | 500 | 700 | 1000 | 2000 |
蛋白分子量范圍 | 500- 150000 | 5000- 1250000 | 10000- 3500000 | 15000- 5000000 | 50000- 7500000 | ＞10000000 |
水溶性高分子范圍 | 500- 25000 | 1000- 100000 | 2000- 500000 | 2500- 500000 | 5000- 1500000 | 50000- 2500000 |
pH | 2-7.5 | |||||
最大壓力（psi） | 4500 | 3500 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 |
色譜柱的異常沖洗
多次使用后某些樣品可能會(huì)吸附到入口篩板或填料上。當(dāng)積累至一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)壓力升高并伴隨峰形展寬的異常現(xiàn)象，需要進(jìn)行特殊的沖洗。
該沖洗的清洗溶液選擇的基本原則：
01
低pH的鹽溶液有助于移除堿性蛋白（如0.5M硫酸鈉溶液，硫酸調(diào)整pH3.0）。
02
有機(jī)溶劑有助于移除疏水蛋白，可以采用含有機(jī)溶劑（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的緩沖溶液（如50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0）。
03
助溶劑有助于去除在固定相上強(qiáng)吸附的物質(zhì)（如通過氫鍵作用等）。
注意：只有在中性鹽溶液或有機(jī)溶劑沒有明顯改善效果的情況下使用助溶劑（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸鈉）。
流速一般采用1/2做樣流速，柱長(zhǎng)≤100mm，各項(xiàng)沖洗60min；柱長(zhǎng)＞100mm，各項(xiàng)沖洗120min。
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